Pembuatan Media dan Sterilisasi

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikrobiologi sangat erat kaitannya dengan mikroorganisme (bakteri, kapang, khamir. Dalam mempelajari mikrobiologi pangan, tentu praktikan akan banyak mengamati unsur-unsur yang terkait dengan mikroorganisme tersebut. Untuk mengamati mikroorganisme tersebut, maka praktikan harus mampu untuk menumbuhkan atau memperbanyak mikroorganisme tersebut.

Mikroorganisme membutuhkan media untuk tumbuh. Media berfungsi untuk tempat tumbuhnya mikroorganisme, isolasi, memperbanyak jumlah, menguji sifat-sifat fisiologi, perhitungan jumlah mikroba, serta sebagai wadah atau tempat zat hara yang digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan. Sebenarnya mikroorganisme tersebut dapat tumbuh di mana saja, asalkan nutrisi dan lingkungannya sesuai. Namun untuk mengoptimalkan pengamatan, digunakan media khusus yang sudah mengandung nutrisi yang diperlukan mikroorganisme yang bersangkutan. Dalam proses pembuatannya, media harus disterilisasi dan menerapkan metode aseptis untuk menghindari kontaminasi pada media itu sendiri. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini agar praktikan dapat membuat media serta mensterilisasi dengan baik dan benar.

1.2 Tujuan

Mahasiswa dapat membuat berbagai macam media dan mengerjakan sterilisasi alat.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2. 1 Pengenalan Media

Media merupakan nutrien yang dibutuhkan mikroorganisme untuk pertumbuhan secara in vitro. Berfungsi secara kualitatif untuk isolasi dan identifikasi mikroorganisme dan secara kuantitatif untuk perbanyakan dan perhitungan jumlah mikroorganisme (Harti, 2015)

Media adalah satu substrat yang diperlukan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakan mikroba. Syarat media adalah:

1. Mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba.

2. Mempunyai tekanan osmotik, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba.

3.  Steril, sebelum ditanami mikroba tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak siinginkan.

Menurut (Pelczar, 1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya digolongkan menjadi 7 golongan, yaitu:

1.  Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum. Contoh Nutrient Agar (NA) untuk menstimulasi pertumbuhan bakteri, Potato Dextose Agar (PDA) untuk menstimulir pertumbuhan fungi.

2.  Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe pertumbuhan mikroba dan  kemampuannya untuk mengadakan perubahan-perubahan kimia tertentu misalnya, medium tetes tebu untuk Saccharomyces cerevisiae.

3.   Media diperkaya (enrichment media), media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu campuran berbagai mikroba contoh Chocolate media dan Yeast-Extract-poptasium Nitrat Agar.

4.   Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan tertentu yang akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang digunakan berupa antibiotik, garamk dan bahan-bahan kimia lainnya.

5.  Media differensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan kimia atau reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.

6. Medium penguji (Assay medium), yaitu medium dengan susunan tertentu yang digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu dengan bantuan bakteri misalnya medium untuk menguji vitamin-vitamin, antibiotika dan lain-lain.

7.  Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan, misalnya medium untuk menghitung jumlah bakteri E. coli air sumur.

Berdasasarkan bentuknya, dengan ada tidaknya bahan tambahan seperti agar-agar atau gelatin, dikenal 3 bentuk media:

1.  Media padat, media yang ditambahi tepung agar-agar sebanyak 12-15%. Media ini umumnya digunakan untuk pertumbuhan bakteri atau kapang.

2.  Media semipadat atau semicair, media yang ditambahi tepung agar-agar yang kurang dari seharusnya. Umumnya digunakan untuk pertumbuhan mikroba yang banyak memerlukan air dan hidup anaerobik dan fakultatif.

3.   Media cair, media yang tidak ditambahi bahan pemadat, umumnya untuk pertumbuhan mikroalga.

Berdasarkan susunannya media terbagi atas:

1.  Media alami yaitu media yang disusun dari bahan-bahan alami seperti kentang, tepung, daging, telur, ikan, sayur dan sebagainya.

2.   Media semi sntesis yaitu media yang disusun dari bahan-bahan alami dan bahan-bahan sintesis.

3.   Media sintesis yaitu media yang disusun dari senyawa-senyawa kimia.

2.2 Sterilisasi

Metode yang lazim digunakan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan oven).

Sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari gelas, logam atau bahan lainnya yang tahan dengan suhu tinggi. Dilakukan dengan cara membiarkan alat gelas di oven selama 2 jam dengan suhu 160-180⁰C. Sterilisasi basah pada umumnya untuk mensterilkan bahan untuk pengujian mikrobiologi. Dilakukan dengan menggunakan uap panas pada suhu 121⁰C dan tekanan 15 psi di dalam autoklaf (Agustine, 2012).

Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat maupun medium mikroorganisme. Prinsip kerja alat ini sama dengan prinsip kerja kukusan (alat sederhana untuk menanak nasi) hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi. Hal ini bertujuan untuk lebih menyempurnakan proses sterilisasi. Tahap sterilisasi sebenarnya cukup singkat yaitu dengan suhu 121 derajat celsius selama 15 menit. Namun waktu keseluruhan mulai dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai pendinginan (penurunan suhu) bisa mencapai kurang lebih dua jam. Yang perlu diperhatikan selama mengoperasikan alat ini adalah tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).

  

III. METODOLOGI

3.1  Alat

·         Aquadest

·         Autoclave

·         Butir Gelas

·         Cawan Petri

·         Erlenmeyer

·         Gelas Ukur

·         Oven

·         Pasir Quarts

·          

3.2  Bahan

·         KH₂PO₄

·         Larutan Pengencer

·         Nutrient Agar

·         Nutrient Broth

·         Plate Count Agar

·         Potato Dextrose Agar

3.3  Prosedur

3.3.1 Pembuatan Medium Nutrient Agar (NA)

1. Nutrient Agar ditimbang sebanyak 23 gram dan dilarutkan dalam 1 L Aquadest kemudian dipanaskan.

2. Diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih.

3. Dimasukkan kedalam botol dan disterilkan.

3.3.2 Pembuatan Medium Nutrient Broth (NB)

1. Nutrient Broth ditimbang sebanyak 13 gram dan dilarutkan dalam 1 L aquadest.

2. Diaduk hingga homogen dan dimasukkan kedalam wadah kemudian disterilkan.

3.3.3 Pembuatan Medium Potato Dextrose Agar (PDA)

1. Potato Dextrose Agar ditimbang sebanyak 39 gram dan dilarutkan dalam 1 L aquadest.

2. Diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih.

3. Dimasukkan kedalam botol dan disterilkan.

3.3.4 Pembuatan Medium Plate Count Agar (PCA)

1. Plate Count Agar ditimbang sebanyak 17,5 gram dan dilarutkan dalam 1 L aquadest.

2. Diaduk hingga homogen dan dipanaskan hingga mendidih.

3. Dimasukkan kedalam botol dan disterilkan.

3.3.5 Pembuatan Larutan Buffer Posfat (KH₂PO₄)

1. KH₂PO₄ ditimbang sebanyak 34 gram dan dilarutkan dalam aquadest.

2. Diatur pH na hingga 7,2  dan ditambah air hingga 1L.

3. 1,25ml larutan stock diencerkan hingga 1L aquadest dan disterilkan.

3.3.6 Pembuatan Larutan Pengencer dan Pasir Quarts

1. 10 gram Pasir ditambahkan kedalam 99 mL larutan pengencer.

2. Disterilkan.

3.3.7 Pembuatan Larutan Pengencer dan Butir Gelas

1. 1 sendok teh butir gelas ditambahkan kedalam 99ml larutan pengencer

2. Disterilkan

3.3.8 Sterilisasi Basah Perebusan

1. Alat-alat dicuci dengan detergen dan dimasukkan ke panic

2. Air dimasukkan hingga terendam dan dipanaskan hingga mendidih

3. Alat-alat dimasukkan kedalam lemari steril dan botol steril siap digunakan untuk mengemas

3.3.9 Autoclave

1. Autoclave diisi dengan aquadest dan tempat penyimpanan alat disimpan di atas penyangga.

2. Alat/bahan/medium dimasukkan kedalam autoclave.

3. Autoclave ditutup dan dinyalakan tombol ON.

4. Diatur suhu pemanasan dan klep ditutup setelah air menetes.

5. Jarum penunjuk dibiarkan kembali ke nol setelah sterilisasi  selesai.

6. Klep di buka, tutup digeser, isi autoclave dikeluarkan.

7. POWER dimatikan.

3.3.10 Sterilisasi Kering

1. Alat-alat dicuci dan dimasukkan kedalam oven kemudian dipanaskan selama 2 jam.

2. Alat-alat steril dimauskkan kedalam lemari steril.

3. Botol steril siap digunakan.

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Pengamatan Pembuatan Media

No Kel	Nama Bahan	Berat (g)	Larutan aquades (mL)	Karakteristik			Kom. Media (gram/L)
				Sebelum dilarutkan	Setelah dilarutkan	Setelah sterilisasi
1B	NaCl fis	0.85	100	Bubuk bewarna putih	Larutan tak bewarna ( bening)	Larutan tak bewarna ( bening)	NaCl
2B	Nutrient Agar (NA)	2	100	Bubuk bewarna coklat muda	Larutan kuning kecoklatan, agak keruh	Padatan agar bewarna coklat muda keruh	- Peptone from meat 5.0 - Meat extract 3.0 - Agar 12.0
3B	Nutrient Broth (NB)	1.3	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning jernih	Larutan bewarna kuning jernih	- Lab Lemco Powder 1.0 - Yeast extract 2.0 - Peptone 5.0 - NaCl 5.0
4B	Potato Dextrose Agar (PDA)	3.9	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning sedikit kecoklatan dan keruh	Padatan agar tak bewarna (bening)	- Potato Infusion 4.0 - Glucose 20.0 - Agar 15.0
5B	Plate Count Agar (PCA)	1.75	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning pucat dan keruh	Padatan agar bewarna oranye muda dan keruh	- Tryptone 5.0 - Yeast extract 2.5 - Glucose 1.0 - Agar 9.0
6B	NaCl fis	0.85	100	Bubuk bewarna putih	Larutan bewarna ungu seulas	Larutan merah muda seulas	NaCl
7B	Nutrient Agar (NA)	2	100	Bubuk bewarna coklat muda	Larutan kuning kecoklatan, agak keruh	Padatan agar bewarna coklat muda keruh	- Peptone from meat 5.0 - Meat extract 3.0 - Agar 12.0
8B	Nutrient Broth (NB)	1.3	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning jernih	Larutan bewarna kuning jernih	- Lab Lemco Powder 1.0 - Yeast extract 2.0 - Peptone 5.0 - NaCl 5.0
9B	Potato Dextrose Agar (PDA)	3.9	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning sedikit kecoklatan dan keruh	Padatan agar bewarna kuning dan agak keruh	- Potato Infusion 4.0 - Glucose 20.0 - Agar 15.0
10B	Plate Count Agar (PCA)	1.75	100	Bubuk bewarna kuning pucat	Larutan bewarna kuning sindur pucat dan keruh	Padatan agar bewarna oranye muda dan keruh	- Tryptone 5.0 - Yeast extract 2.5 - Glucose 1.0 - Agar 9.0
11B	NaCl fis	0.85	100	Bubuk bewarna putih	Larutan tak bewarna ( bening)	Larutan tak bewarna ( bening)	NaCl

4.2. Pembahasan

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan berbagai macam medium pertumbuhan bakteri Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme harus sesuai komposisinya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan.

Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya. (Volk, dan Wheeler,1993).

Setelah pembuatan media, tentu media tersebut sebelum digunakan harus disterilisasi terlebih dahulu. Sterilisasi merupakan hal terpenting dalam praktikum mikrobilogi, karena jika tidak menggunakan peralatan dan media yang tidak steril maka akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme atau terkontaminasi.

4.2.1. Pembuatan Media

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan berbagai macam medium yaitu  NaCl fis 0.85%, Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (N4B), Potato Dextrose Agar (PDA) dan Plate Count Agar (PCA). Pada umumnya media dibuat dengan cara pelarutan (untuk menghomogenkan media) -> cek pH (agar pH pertumbuhan mikroorganisme sesuai, biasanya digunakan HCl dan NaOH untuk adjust pH) -> pendidihan (agar media larut dalam air, umumnya yang dididihkan media agar, karena agar kurang larut dengan air dingin sehingga diperlukan pendidihan) -> sterilisasi basah (menggunakan autoklaf 121⁰C 15 psi 15 menit, namun beberapa media ada yang membuatnya dengan cara sterilisasi, cek botol media terlebih dahulu untuk cara pembuatannya). Media yang sudah jadi dapat ditaruh di lemari es dan ketika akan digunakan kembali dididihkan kembali kemudian ditaruh di waterbath dengan suhu sekitar 60⁰C supaya media agar tetap cair ketika akan ditunangkan ke cawan petri atau ke dalam tabung reaksi.

4.2.1.1. NaCl fisiologis

NaCl fisiologi merupakan larutan pengencer. Jenis pengenceran terbagi menjadi tiga. Pertama, pengenceran menggunakan aquades yang paling tidak teliti dibandingkan dengan dua pengenceran lainnya. Kedua, pengenceran dengan NaCl-fisiologis, memiliki ketelitian lebih baik dibanding dengan menggunakan aquades. Ketiga, larutan buffer fosfat yang paling teliti. Larutan pengencer yang sering digunakan yaitu NaCl fisiologis 0.85 %, buffer fosfat (KH₂PO_4, dan K₂PO₄), dan larutan ringer. Larutan pengencer berfungsi untuk membuat atau mengencerkan media/substrat pertumbuhan mikrooraganisme agar konsentrasi dari media tidak terlalu pekat dan memudahkan mikroorganisme tumbuh serta memudahkan dalam perhitungan jumlah mikroorganisme.

Selain itu, bila bakteri dikultivasi di dalam suatu medium yang mula-mula disesuaikan pHnya, misalnya 7, maka mungkin sekali pH ini akan berubah sebagai akibat adanya senyawa-senyawa asam atau basa yang dihasilkan selama pertumbuhannya. Pergeseran pH ini dapat sedemikian besar sehingga menghambat pertumbuhan seterusnya organisme itu. Pergeseran ini dapat dicegah dengan menggunakan larutan penyangga (Pelczar, 1986).

NaCl fisiologis yang akan dibuat pada praktikum kali ini yaitu sebanyak 100 mL, banyaknya NaCl yang ditimbang adalah 0.85%w/v x100 mL = 0.85 gram. Pada kelompok 6B terdapat perbedaan warnayaitu sedikit keunguan setelah dilarutkan dan merah muda seulas setelah disterilkan, hal ini disebabkan karena beaker glass yang digunakan terdapat sedikit media EMB (Eosin Methylene Blue) yang bewarna ungu. Setelah ditimbang NaCl fisiologis dilarutkan dalam aquades kemudian disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121⁰C, 15 psi selama 15 menit. Pada NaCl fisiologis tidak usah dididihkan karena bubuk NaCl larut sempurna dalam air sehingga tidak perlu dididihkan.

4.2.1.2. Nutrient Agar (NA)

Nutrient Agar (NA) merupakan medium umum berwarna kuning muda yang bersifat semi sintetis yang digunakan untuk media pertumbuhan berbagai jenis bakteri. NA biasa digunakan untuk uji air, uji bakteri pada produk pangan, dan untuk mengisolasi organisme dalam kultur murni. Komposisi medium NA diantaranya yaitu beef extract, gelatin peptone, dan bacteriological agar. Beef extract berfungsi sebagai sumber nutrisi untuk pertumbuhan bakteri, sedangkan agar berfungsi sebagai bahan pemadat medium. Pada pembuatan medium NA ini ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung banyak N₂ (Dwidjoseputro, 1994).

Media NA yang akan dibuat pada praktikum kali ini yaitu sebanyak 100 mL, pada botol tertulis untuk membuat media NA dibutuhkan 20 gram NA dalam 1 L aquades, bubuk NA ini bewarna coklat muda, maka banyaknya NA yang ditimbang adalah 20g/1000mLx100 mL = 2 gram. Setelah ditimbang NA dilarutkan dalam aquades dan dididihkan agar bubuk  NA semuanya larut dan homogen dan warna larutan setelah dilarutkan yaitu coklat muda dengan larutan agak keruh, kemudian media NA disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121⁰C, 15 psi selama 15 menit. Setelah disterilisasi didapatkan hasil padatan agar bewarna coklat muda keruh.

4.2.1.3. Nutrient Broth (NB)

Nutrient Broth (NB) adalah medium yang berbentuk cair dengan bahan dasar adalah ekstrak beef dan peptone. Perbedaan konsentris antara Nutrient Agar dengan Nutrient Broth yaitu NA berbentuk padat dan NB berbentuk cair. Susunan kimia sama-sama sintetik. Fungsi kimia dari NA dan nutrient broth sebagaimedium umum. Medium Nutrient Broth (NB) merupakan medium yang berwarna coklat yang memiliki konsistensi yang cair dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai medium untuk menumbuhkan bakteri sama seperti medium NA.

Media NB yang akan dibuat pada praktikum kali ini yaitu sebanyak 100 mL, pada botol tertulis untuk membuat media NB dibutuhkan 13 gram NB dalam 1 L aquades, bubuk NA ini bewarna kuning, maka banyaknya NB yang ditimbang adalah 13g/1000mLx100 mL = 1.3 gram. Setelah ditimbang NB dilarutkan dalam aquades setelah dilarutkan menjadi larutan bewarna kuning yang jernih, kemudian media NB disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121⁰C, 15 psi selama 15 menit. Pada NB tidak usah dididihkan karena bubuk NB larut sempurna dalam air sehingga tidak perlu dididihkan.

4.2.1.4. Potato Dextrose Agar (PDA)

Media PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk pertumbuhan, isolasi dan enumerasi dari kapang dan khamir pada bahan makanan dan bahan lainnya. Karbohidrat dan senyawa yang diambil dari kentang mendukung pertumbuhan khamir dan kapang dan pada kondosi pH yang diturunkan dapat menghambat pertumbuhan kontaminan (bakteri yang ikut). Jika medium ini dipakai untuk perhitungan jamur, pH medium harus diturunkan hingga 3,5 karena jamur akan tumbuh pada medium ini untuk mengembangkan morfologinya (Thatcher and Clark, 1987).

Fungsinya sebagai media selektif untuk pertumbuhan jamur dan yeast hingga sering digunakan sebagai uji untuk menentukan jumlah jamur dan yeast yang dilakukan dengan menumbuhkan mikroba pada permukaan sehingga akan membentuk koloni yang dapat diikat atau dihitung (Fardiaz, 1993). Berdasarkan komposisinya PDA termasuk medium semi sintetik tidak dapat diketahui secara pasti komposisi senyawa penyusunnya sedangkan menurut fungsinya, PDA termasuk dalam medium umum karena cocok untuk mengidentifikasi pertumbuhan kapang dan khamir.

Media PDA yang akan dibuat pada praktikum kali ini yaitu sebanyak 100 mL, pada botol tertulis untuk membuat media PDA dibutuhkan 39 gram PDA dalam 1 L aquades, bubuk PDA ini bewarna kuning kecoklatan, maka banyaknya PDA yang ditimbang adalah 39g/1000mLx100 mL = 3.9 gram. Setelah ditimbang PDA dilarutkan dalam aquades dan dididihkan agar bubuk  PDA semuanya larut dan homogen dan warna larutan setelah dilarutkan yaitu kuning sedikit kecoklatan dengan larutan agak keruh, kemudian media PDA disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121⁰C, 15 psi selama 15 menit. Pada hasil setelah sterilisasi terdapat pebedaan pada kedua kelompok, pada kelompok 4B padatan agar tak bewarna dan pada kelompok 9B padatan agar bewarna kuning dan agak keruh. Hal ini wajar terjadi karena setiap kita membuat media, warna yang dihasilkan tidak selalu sama.

4.2.1.5. Plate Count Agar (PCA)

          Plate Count Agar (PCA) atau yang juga sering disebut dengan Standard Methods Agar (SMA) merupakan sebuah media pertumbuhan mikroorganisme yang umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri total (semua jenis bakteri) yang terdapat pada setiap sampel seperti makanan, produk susu, air limbah dan sampel-sampel lainnya yang juga biasanya menggunakan metode Total Plate Count (TPC). Plate Count Agar (PCA) merupakan media padat, yaitu media yang mengandung agar sehingga setelah dingin media tersebut akan menjadi padat (Addina, 2014)

          Media PCA yang akan dibuat pada praktikum kali ini yaitu sebanyak 100 mL, pada botol tertulis untuk membuat media PCA dibutuhkan 17.5 gram PCA dalam 1 L aquades, bubuk PCA ini bewarna kuning, maka banyaknya PCA yang ditimbang adalah 17.5g/1000mLx100 mL = 1.75 gram. Setelah ditimbang PCA dilarutkan dalam aquades dan dididihkan agar bubuk PCA semuanya larut dan homogen dan warna larutan setelah dilarutkan yaitu kuning sindur dengan larutan agak keruh, kemudian media PCA disterilkan pada autoklaf dengan suhu 121⁰C, 15 psi selama 15 menit. Hasil dari sterilisasi yaitu padatan agar bewarna oranye muda dan keruh.

4.2.2. Sterilisasi

Metode yang lazim digunakan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan. Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan oven).

Sterilisasi kering digunakan untuk mensterilkan alat-alat yang terbuat dari gelas, logam atau bahan lainnya yang tahan dengan suhu tinggi. Dilakukan dengan cara membiarkan alat gelas di oven selama 2 jam dengan suhu 160-180⁰C. Sterilisasi basah pada umumnya untuk mensterilkan bahan untuk pengujian mikrobiologi. Dilakukan dengan menggunakan uap panas pada suhu 121⁰C dan tekanan 15 psi di dalam autoklaf (Agustine, 2012).

Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat maupun medium mikroorganisme. Prinsip kerja alat ini sama dengan prinsip kerja kukusan (alat sederhana untuk menanak nasi) hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi. Hal ini bertujuan untuk lebih menyempurnakan proses sterilisasi. Tahap sterilisasi sebenarnya cukup singkat yaitu dengan suhu 121 derajat celsius selama 15 menit. Namun waktu keseluruhan mulai dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai pendinginan (penurunan suhu) bisa mencapai kurang lebih dua jam. Yang perlu diperhatikan selama mengoperasikan alat ini adalah tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994).

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam sterilisasi menggunakan autoklaf di laboratorium mikrobiologi pangan yaitu:

1.     Air di dalam autoklaf tidak boleh terlalu sedikit karena jika terlalu sedikit dalam prosesnya air akan habis dan di dalam autoklaf kering, hal itu sangat membahayakan, mengingat tekanan di dalam autoklaf cukup tinggi.

2.   Tutup autoklaf harus ditutup dengan benar agar proses pensterilan di dalam autoklaf berjalan dengan baik.

3.    Setelah air menetes keluar, klep pengaman ditutup agar tekanan di dalam naik dan suhu 121 derajat celsius dapat tercapai karena titik didih akan naik bila tekanan naik.

4.        Setelah proses sterilisasi selesai jangan langsung membuka tutup autoklaf, melainkan menunggu tekanan di dalam autoklaf 0, bila tidak, tutup autoklaf akan terlempar karena tekanan di dalam autoklaf.

5.                  Setelah sterilisasi selesai dimatikan autoklaf, dibiarkan dingin, dibuka klep udara dan tutup autoklafnya kemudian keluarkan alat/bahan yang sudah steril.

V. KESIMPULAN

Praktikum pembuatan media dan sterilisasi kali ini dapat disimpulkan sebagai berikut :

1. Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan (nutrien)  yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan mikroorganisme.

2.  Terdapat berbagai macam medium berdasarkan bentuknya, komposisi, dan fungsinya.

3.  Pada umumnya medium dibuat dengan cara pelarutan, pendidihan dan sterilisasi basah.

4.  Pada pembuatan medium NA, PCA, NB dapat digunakan untuk pertumbuhan mikroba secara umum.

5.  Medium NA, PCA dan PDA merupakan medium padat.

6.  Medium NB dan NaCl fisologis merupakan medium cair.

7.  Sterilisasi adalah suatu usaha untuk membebaskan alat-alat, bahan, dan kemasan dari segala macam bentuk kehidupan terutama mikroorganisme.

8. Sterilisasi terdapat 2 macam yaitu sterilisasi basah dan sterilisasi kering. Sterilisasi basah menggunakan autoklaf dan sterilisasi kering menggunakan oven.

DAFTAR PUSTAKA

Addina, Ghina. 2014. Evaluasi Kadar Bakteri di Udara dengan Menggunakan      Media Plate Count Count Agar (PCA) berdasarkan Tinggi secara Vertikal       di Departemen Bedah Mulut RSGMP FKG USU dengan Merode Total Plate Count (TPC). Medan: Universitas Sumatera Utara.

Agustine, Hadiati, dkk. 2012. Mikrobologi. Bogor: Kemenperin Pusdiklat Industri             Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Pelczar. 1996. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Depok: Universitas Indonesia.

Srikandi Fardiaz. 1989. Mikrobiologi Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor.

Staples,C.R.W.W. Thatcher, and J.H. Clark. 1990. Relationship Between Ovarian Activity and Energy  Status During the Early Perpertum Period of High  Producing Diary Cows.J. Diary Sci.73: 939—949

Volk, A. Wesley dan Wheeler, F. Margaret. 1990. Mikrobiologi Dasar. Jilid Edisi kelima.

 JAWABAN PERTANYAAN

1.  Setelah saudara pelajari dan dipraktikan, jelaskan fungsi penambahan beef extract pada pembuatan media NA dan fungsi penambahan kentang pada pembuatan media PDA! Mengapa berbeda?

Jawab :

Fungsi beef extract untuk menumbuhkan atau mengembangkan mikroorganisme yang tumbuh pada media tersebut yaitu menumbuhkan bakteri, kapang, dan khamir.

Sedangkan penambahan kentang untuk menumbuhkan mikroorganisme namun hanya pada kapang dan khamir, kentang digunakan ekstrak kentang karena kentang sebagai sumber karbon (karbohidrat), vitamin, dan energi.

2.  Jelaskan fungsi dari larutan pengencer? mengapa harus menggunakan KH₂PO₄? Dapatkah digantikan dengan senyawa kimia lain?

Jawab :

Larutan pengencer digunakan untuk membuat media/substrat pertumbuhan bakteri agar konsentrasinya tidak terlalu pekat dan memudahkan mikroorganisme tumbuh.

KH₂PO₄ dapat diganti dengan senyawa lain, tetapi memiliki sifat yang sama yaitu sebagai larutan penyangga (buffer) asam yang dapat mempertahankan pH pada daerah asamnya (pH = 7).

PDFnya disini atau ini
Kalau linknya bermasalah bisa komen di bawah atau kontak aku di ig ya